MitoLite 線粒體紅色熒光探針是一種陽(yáng)離子染料，可以通過(guò)線粒體膜電位梯度選擇性地積聚在線粒體中。線粒體指示劑是一種疏水性化合物，很容易透過(guò)完整的活細(xì)胞，并在進(jìn)入細(xì)胞后被線粒體捕獲。這種熒光線粒體指示劑長(zhǎng)時(shí)間保留在線粒體中，因?yàn)樵撝甘緞в屑?xì)胞保留基團(tuán)。這一關(guān)鍵特性顯著提高了染色效率。它可以很容易地適用于各種熒光平臺(tái)，如微孔板分析，免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)。它適用于增殖和非增殖細(xì)胞，可用于懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞。

操作步驟

1.準(zhǔn)備線粒體染色溶液：

1.1解凍MitoLite 染料至室溫。

1.2通過(guò)將20μL500X Mitolite 染料稀釋到10 mL Hanks和20 mm Hepes緩沖液或緩沖液（HBSS）中，制備染料工作溶液。

注1：20μLMitolite 染料足以用于一個(gè)96孔板。 在<-15℃下分裝并儲(chǔ)存未使用的MitoLite 染料儲(chǔ)備溶液。 保護(hù)它免受光照，避免反復(fù)凍融循環(huán)。

注2：熒光線粒體指示劑的最佳濃度根據(jù)具體應(yīng)用而變化。 可以根據(jù)特定細(xì)胞類型和細(xì)胞或組織對(duì)探針的滲透性來(lái)修改染色條件。

2.準(zhǔn)備和染色細(xì)胞：

2.1對(duì)于貼壁細(xì)胞：a.在96孔黑色壁/透明底板（100μL/孔/ 96孔板）中或在裝有適當(dāng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需的匯合時(shí)，加入等體積的染料工作溶液（來(lái)自步驟1.2）。 b.將細(xì)胞在37oC，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至2小時(shí)。 c.用預(yù)熱（37oC）Hanks和20 mM Hepes緩沖液（HBSS）或您選擇的緩沖液（例如濃度為1：1的生長(zhǎng)培養(yǎng)基緩沖液）替換染料加載溶液或清洗（特別是對(duì)于＃22679）細(xì)胞。用HBSS或生長(zhǎng)培養(yǎng)基填充細(xì)胞孔。 d.使用配有所需濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注意：如果細(xì)胞看起來(lái)沒(méi)有充分染色，建議增加標(biāo)記濃度或孵育時(shí)間以使染料積累。

2.2對(duì)于懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞以1000rpm離心5分鐘以獲得細(xì)胞沉淀并吸出上清液。在預(yù)熱（37℃）生長(zhǎng)培養(yǎng)基中輕輕重懸細(xì)胞沉淀，并加入等體積的染料加工溶液（來(lái)自步驟1.2）。將細(xì)胞在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至2小時(shí)。用Hanks和20mM Hepes緩沖液（HH緩沖液）或緩沖液替換染料加載溶液或洗滌（特別是對(duì)于＃22679）。（例如生長(zhǎng)培養(yǎng)基濃度為1：1的緩沖液）。用HBSS或生長(zhǎng)培養(yǎng)基填充細(xì)胞孔。使用配有所需濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注1：如果細(xì)胞看起來(lái)沒(méi)有充分染色，建議增加標(biāo)記濃度或培養(yǎng)時(shí)間以使染料積累。

注2：懸浮細(xì)胞可以附著在用BD Cell-Tak?（BD Biosciences）處理過(guò)的蓋玻片上，并作為粘附細(xì)胞染色（見(jiàn)步驟2.1）。