蛋白酶測定法廣泛用于蛋白酶抑制劑的研究和蛋白酶活性的檢測。監(jiān)測各種蛋白酶活性已成為許多生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)任務(wù)。 一些蛋白酶已被確定為良好的藥物開發(fā)目標(biāo)。

我們的Amplite 通用熒光蛋白酶活性檢測試劑盒是進(jìn)行常規(guī)檢測分離蛋白酶或鑒定蛋白質(zhì)樣品中污染蛋白酶的理想選擇。該試劑盒使用熒光酪蛋白偶聯(lián)物，其被證明是廣譜蛋白酶（例如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和彈性蛋白酶）的通用底物。在完整的底物中，酪蛋白用綠色熒光染料嚴(yán)重標(biāo)記，導(dǎo)致顯著的熒光猝滅。蛋白酶催化的水解減輕了其猝滅效應(yīng)，產(chǎn)生明亮的熒光染料標(biāo)記的短肽。熒光強(qiáng)度的增加與蛋白酶活性成正比。 該測定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行，并且易于適應(yīng)自動化。使用FITC濾光片組，可以使用熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 490/525 nm下輕松讀取其信號。

操作方法

1.準(zhǔn)備工作解決方案：

1.1制備蛋白酶底物溶液：在2X測定緩沖液（組分C）中以1：100稀釋蛋白酶底物（組分A）。在96孔板中每次測定使用50μL蛋白酶底物溶液。

注意：2X分析緩沖液（組分C）設(shè)計(jì)用于檢測胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和人白細(xì)胞彈性蛋白酶的活性。對于其他蛋白酶，請參閱附錄I了解適當(dāng)?shù)姆治鼍彌_液配方。

1.2胰蛋白酶稀釋：在去離子水中以1:50稀釋胰蛋白酶（5U /μL，組分B），得到濃度為0.1U /μL。

2.根據(jù)說明書中的表1和表2，將步驟1中制備的試劑加入96孔微量培養(yǎng)板中。

3.運(yùn)行酶促反應(yīng)：

3.1將50μL蛋白酶底物溶液（來自步驟1.1）加入到測定板中的所有孔中，充分混合試劑。

3.2用Ex / Em = 490 / 525nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測熒光增加。

對于動力學(xué)讀數(shù)：立即開始連續(xù)測量熒光強(qiáng)度，每5分鐘記錄數(shù)據(jù)30分鐘。

終點(diǎn)讀數(shù)：將反應(yīng)在所需溫度下孵育30至60分鐘，避光，測量熒光強(qiáng)度。